Un metodo semplice per identificare una cellula geneticamente e determinare rapidamente tutte le sequenze di DNA nel genoma che regolano l’espressione di uno specifico gene.
di MIT Technology Review Italia
L’esplosione di metodologie per la manipolazione genetica sta trasformando la medicina, l’agricoltura, le pratiche di allevamento e forse anche il futuro della razza umana. Il metodo CRISPR/Cas9, la cui scoperta è valsa il Premio Nobel per la Chimica 2020, permette di sostituire porzioni predefinite di DNA con precisione e velocità senza precedenti, nonchè a costi molto bassi.
Una squadra di ricercatori della University of California, Berkeley, ha sviluppato un modo semplice per condurre diverse migliaia di esperimenti contemporaneamente, usando la CRISPR per modificare individualmente ogni gene di un genoma e osservare rapidamente l’impatto di ciascuna alterazione. L’innovazione consente a chiunque di profilare una cellula e determinare rapidamente tutte le sequenze di DNA nel genoma che regolano l’espressione di un gene specifico. La ricerca è stata descritta sulla rivista Science.
Condotta sotto la direzione di Nicholas Ingolia, associate professor di biologia molecolare e cellulare della UC Berkeley, la nuova tecnica sarà utile soprattutto ai ricercatori di base interessati a monitorare l’influenza di ciascun gene sulla rete genetica, ma sarà utile anche nell’individuare rapidamente le sequenze regolatorie che controllano i geni di una malattia e possibilmente scoprire nuovi bersagli per i farmaci.
Nel caso del cancro, per esempio, una malattia di cui si conoscono le alterazioni genetiche da cui scaturisce, la tecnica consentirebbe di scoprire quali geni agiscono a monte, si comportano da regolatori dei geni che già conosciamo. Questi geni regolatori potrebbero rivelarsi più facili da trattare.
Utilizzando lo strumento di editing genetico CRISPR-Cas9, per identificare la funzione di uno specifico gene, i ricercatori non hanno che da indirizzare un frammento di RNA guida complementare al DNA del gene, perchè la proteina Cas9 si leghi ad esso per ‘tagliarlo’ o inibirlo. L’utilizzo del metodo CRISPR rende facile esaminare in modo completo tutti i geni nel genoma e interferire con le loro funzioni, ma rimane la necessità di interpretare gli effetti delle alterazioni effettuate.
La nuova tecnica, che Ingolia chiama interferenza CRISPR interference with barcoded expression reporter sequencing, o CiBER-seq, risolve questo problema consentendo di eseguire simultaneamente decine di migliaia di esperimenti CRISPR. La tecnica impiega un sequenziamento profondo per misurare direttamente l’aumento o la diminuzione dell’attività dei geni nel pool. Il sequenziamento profondo utilizza una tecnologia di sequenziamento di nuova generazione ad alta velocità e lettura lunga per sequenziare ed essenzialmente contare tutti i geni espressi nei campioni selezionati.
L’innovazione chiave introdotta dai ricercatori è stata collegare ogni sgRNA con una sequenza nucleotidica unica e casuale – essenzialmente, un codice a barre – collegata a un promotore che trascriverà il codice a barre solo se anche il gene di interesse è attivato. Ciascun codice a barre riporta l’effetto di uno sgRNA, mirando individualmente a un gene da un pool complesso di migliaia di sgRNA.
Il sequenziamento profondo ti dice le abbondanze relative di ogni codice a barre nel campione – per il lievito, circa 60.000 – consentendo di valutare rapidamente quale dei 6.000 geni nel lievito ha un effetto sul promotore e, quindi, sull’espressione del gene di interesse. Nel caso delle cellule umane, si potrebbero inserire più di 200.000 differenti RNA guida, prendendo di mira ciascun gene ripetutamente.
La tecnica permette quindi di cogliere sfumature più precise della fisiologia di ciascuna cellula.
(lo)
